Mỹ Duyên tên thật là Lê Huỳnh Mỹ Duyên, sinh năm 1972 tại Sài Gòn. Gia đình có truyền thống về nghệ thuật, ngay từ nhỏ, chị đã được định hướng trở thành một diễn viên múa ballet giống mẹ. Năm 10 tuổi, Mỹ Duyên được gửi sang Liên Xô để theo học ballet. Năm 1990, Mỹ Duyên tốt nghiệp và trở về quê hương. Tuy vậy, chị không theo đuổi nghiệp múa ballet bởi không tìm thấy nơi phù hợp để thực hiện niềm đam mê. Mỹ Duyên về nước được khoảng bảy năm thì mẹ Duyên mất. Ba năm sau, cha chị cũng qua đời. Mỹ Duyên phải sống một mình.
Mỹ Duyên xin vào làm tại Nhà hát Hòa Bình với công việc múa minh họa và biểu diễn thời trang trong các chương trình tạp kỹ. Năm 1992, chị tham dự một cuộc thi tuyển chọn diễn viên cho bộ phim "Vĩnh biệt mùa hè" của đạo diễn Lê Hoàng Hoa. Vai diễn sau đó thuộc về diễn viên Việt Trinh, vốn đang rất nổi tiếng.
Cùng năm 1992, đạo diễn Lê Hoàng Hoa mời Mỹ Duyên đóng vai nhỏ trong phim cổ trang "Ngọc trản thần công" (hay "Tây Sơn hiệp khách" phần hai). Sau đó, Mỹ Duyên gặp gỡ đạo diễn Lê Hoàng. Chị được Lê Hoàng mời đóng "Vị đắng tình yêu 2" trong vai ca sĩ người Đài Loan. Bộ phim không được đánh giá cao nhưng Mỹ Duyên gây được ấn tượng cho khán giả nhờ sự mới mẻ. Thời ấy, nữ diễn viên được chú ý bởi đôi mắt tròn, sáng cùng hàm răng khểnh.
Năm 1993, Mỹ Duyên được Lê Hoàng mời đóng vai chính trong phim "Trái tim chó sói" cùng diễn viên Lê Công Tuấn Anh. Thành công liên tục đến với nữ diễn viên sau đó. Gặt hái lớn nhất của chị là vai diễn Lan Hương trong phim "Tình nhỏ làm sao quên".
Năm 1995, Nhà hát Giao hưởng Vũ kịch TP HCM được thành lập và nhận Mỹ Duyên vào biểu diễn. Ngoài diễn xuất trên màn ảnh và sân khấu, thời này, Mỹ Duyên còn được mời làm người mẫu ảnh. Chị thường xuyên được mời chụp ảnh lịch.
Thời gian sau đó, Mỹ Duyên tiếp tục gây ấn tượng với nhiều bộ phim như: "Lương tâm bé bỏng", "Giọt lệ chưa khô", "Ngõ đàn bà", "Chiếc chìa khoá vàng", "Lời thề"... Chị nhận được nhiều giải thưởng ở trong nước. Trong các bộ phim, phần lớn Mỹ Duyên hóa thân thành típ nhân vật hiền lành, ngây thơ.
Năm 2002, Mỹ Duyên tham gia phim "Gái nhảy" của Lê Hoàng. Vai diễn cô gái làng chơi chết vì ma túy và HIV/AIDS của chị được đánh giá cao. Tiếp đó, chị thử sức với nhiều dạng vai hơn trong "Lọ lem hè phố", "Nữ tướng cướp"...
Năm 2007, Mỹ Duyên được trao tặng danh hiệu Nghệ sỹ Ưu tú. Sau đó, chị chủ yếu phát triển sự nghiệp ở sân khấu kịch.
Ngoài đời, chị là người sống trầm lặng và ít nói. Năm 2014, Mỹ Duyên kết hôn ở tuổi 42. Chồng chị là anh Huỳnh Công Phước - một người gốc Huế nhưng sinh sống ở Đức đã lâu. Họ chung sống với nhau nhiều năm và có con trước khi quyết định tổ chức đám cưới. Nhớ lại thời mới gặp, anh Phước tâm sự: "Tôi thấy cô gái này sao mà thật thà, bình dị đến thế. Duyên nổi tiếng nhưng sống rất giản dị, cư xử tự nhiên, chân thành".
Bé Philly là con trai của Mỹ Duyên và chồng. Cậu bé chào đời năm 2012. Trong ảnh, vợ chồng Mỹ Duyên đưa con tới một sự kiện ra mắt phim năm 2016. Trong mắt Mỹ Duyên, chồng là người đàn ông tốt nhưng đòi hỏi cao. Với anh, nhà cửa lúc nào cũng phải sạch sẽ, ngăn nắp.
Mới đây, Mỹ Duyên tham gia bộ phim "Tháng năm rực rỡ". Cô vào vai Thùy Linh - một phụ nữ nhiều đam mê. Ở tuổi 46, Mỹ Duyên vẫn giữ được nét duyên dáng. Lối diễn xuất của chị trong phim gây được nhiều cảm tình cho khán giả.