Năm 1613, chúa Nguyễn Hoàng lâm bệnh nặng. Ông cho gọi con thứ sáu là Nguyễn Phúc Nguyên về kế vị và căn dặn “nếu Bắc tiến được thì tốt nhất, bằng không giữ vững đất Thuận Quảng và mở mang bờ cõi về phía nam. Đất Thuận Quảng này phía bắc có núi Hoành Sơn, sông Linh Giang, phía Nam có núi Hải Vân và Bi Sơn, thật là đất của người anh hùng dụng võ. Vậy con phải biết thương yêu dân, luyện tập binh sĩ để xây dựng cơ nghiệp muôn đời”.
Theo Đại Nam thực lục, ông cũng nói với các cận thần lúc hấp hối bên giường bệnh: “Ta với các công cùng nhau cam khổ đã lâu, muốn dựng nên nghiệp lớn. Nay ta để gánh nặng lại cho con ta, các ông nên cùng lòng giúp đỡ, cho thành công nghiệp”.
Nguyễn Hoàng trấn thủ đất Thuận Quảng 55 năm, thọ 89 tuổi. Ban đầu mộ Nguyễn Hoàng được táng ở vùng núi Thạch Hãn, huyện Hải Lăng, phủ Triệu Phong (nay thuộc huyện Hải Lăng, Quảng Trị), về sau được cải táng lăng mộ chuyển về núi La Khê tức Khải Vận Sơn (nay thuộc huyện Hương Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế).
Năm 1804, vua Gia Long cho dựng Thái Miếu rộng mười ba gian để thờ các chúa Nguyễn và các công thần đời trước, chúa Tiên Nguyễn Hoàng cùng Hoàng hậu được thờ ở áng chính giữa.