Tháng 5/1545, Nguyễn Kim quyết định mở cuộc tấn công lớn ra Bắc. Lê Trang Tông sai thái úy Đinh Công coi giữ ngự dinh còn tự mình đem các tướng tiến ra miền Sơn Nam, đóng dinh ở Yên Mô (Ninh Bình).
Tại Yên Mô, Nguyễn Kim bị hàng tướng triều Mạc là Dương Chấp Nhất đầu độc chết. Đại Việt sử ký toàn thư chép: “Ngày 20/5, hàng tướng Mạc là Trung Hậu ngầm chứa hai lòng, mời thái tể Nguyễn Kim đến dinh của hắn, bỏ ngầm thuốc độc trong quả dưa dâng lên trước mâm cỗ. Kim tin thực ăn dưa, bị trúng độc, đến khi về thấy trong người khó chịu rồi mất. Trung Hậu đêm ấy trốn đi, quay về với họ Mạc”.
Vua Lê Trang Tông vô cùng thương tiếc Nguyễn Kim, liền xuống chiếu truy tặng là Huân Tĩnh công, thụy là Trung Hiến, sai người rước về Bái Trang, huyện Tống Sơn (nay thuộc Hà Trung, Thanh Hóa) để hậu táng. Vua phong con trưởng của Nguyễn Kim là Nguyễn Uông làm lãng quận công, con thứ tên Hoàng làm hạ khê hầu, sai đem quân đi đánh giặc.
Nguyễn Kim mất, Trịnh Kiểm được vua Lê phong làm Lượng quốc công, thay Nguyễn Kim nắm giữ binh quyền, tiếp tục sự nghiệp trung hưng.